Epitranscriptomic deregulation in bladder cancer: implications for tumour aggressiveness

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019O cancro de bexiga é o nono cancro mais incidente no mundo e a décima terceira principal causa de morte por cancro, de acordo com o estudo GLOBOCAN 2018. A maioria dos casos de cancro de bexiga (> 90%) surge no revestimento interno do trato urinário (urotélio) e são designados por carcinoma de células uroteliais. Os subtipos menos comuns são o carcinoma espinocelular, adenocarcinoma, carcinoma de pequenas células e sarcoma. Adicionalmente, o cancro de bexiga pode ser classificado em não músculo-invasivo e em músculo-invasivo. Este primeiro, é responsável por aproximadamente 75% de todos os cancros de bexiga diagnosticados. Apesar destes tumores, geralmente, não representarem uma ameaça à vida dos doentes, a taxa de recorrência é elevada. Por outro lado, tumores músculo-invasivos, que representam cerca de 25% dos casos, são tumores clinicamente mais agressivos, que podem progredir rapidamente, apresentando capacidade de invadir e metastizar para outros órgãos. Assim, há uma necessidade urgente de compreender os mecanismos de progressão do cancro de bexiga, para assim desenvolver novas estratégias de diagnóstico, bem como abordagens terapêuticas efetivas. Nos últimos anos, o número de estudos na área da genética, epigenética e epitranscriptómica aumentaram drasticamente, principalmente devido ao rápido aprimoramento das tecnologias de sequenciação de alto rendimento de nova geração. CH Waddington, definiu originalmente o termo Epigenética como o estudo de "mecanismos causais pelos quais os genes do genótipo produzem efeitos fenotípicos". Ao longo do tempo, esta definição sofreu algumas alterações, sendo, hoje, definida como “o estudo de alterações hereditárias na expressão génica que ocorrem independentemente das alterações na sequência primária de ADN". Recentemente foram identificados novos mecanismos de regulação da expressão génica, ao nível do ácido ribonucleico (ARN), designado por epitranscriptómica. Esta refere-se ao estudo de modificações químicas, reversíveis, que podem ocorrer quer em moléculas de ARN, quer em ARN não codificante (ncARN) e em ARN mensageiro (mARN). A N6-metiladenosina (m6A), metilação da adenosina na posição nitrogénio-6, é a modificação química interna mais abundante nos mARNs dos seres eucarióticos. Esta modificação ocorre, preferencialmente, na sequência DRACH (onde D indica A/G/U; R indica A/G e H indica A/C/U), sendo especificamente enriquecida próximo do codão stop, nas regiões 3' não-traduzidas e em grandes exões internos. O seu potencial na regulação da expressão génica foi recentemente explorado e sabe-se que, esta modificação pode afetar diferentes vias do mARN, como a transcrição, splicing, exportação do núcleo e tradução. Nas células de mamíferos, esta modificação é catalisada pelo complexo m6A metiltransferase ("writters") e pode ser removida pelas desmetilases ("erasers"). Além disso, existem proteínas que se ligam diretamente à modificação m6A, mediando a sua função. Estas são conhecidas como “readers”. Vários estudos revelaram que a metilação do m6A, bem como das suas proteínas reguladoras, desempenha um papel crucial no processo de tumorigénese em diferentes modelos. No entanto, o envolvimento desta modificação no cancro de bexiga é ainda limitado, sendo, portanto, necessário investigar as suas funções no contexto desta neoplasia. O objetivo do nosso estudo é descobrir o papel da m6A no cancro de bexiga, a fim de perceber quais os mecanismos moleculares subjacentes à agressividade tumoral. A seleção das proteínas reguladoras da m6A mais informativas para o nosso projeto foi realizada pela análise in silico dos dados de ARN-seq de doentes com cancro de bexiga músculo-invasivo, disponíveis na base de dados do TCGA. Esta análise revelou que as principais proteínas reguladoras da m6A desreguladas eram o METTL3, METTL14, VIRMA, WTAP, que formam um “writter complex”, sendo o METTL3 a única proteína com atividade catalítica, o ALKBH5 e FTO, que têm a capacidade de desmetilar o m6A, e o YTHDF3 que tem como função “ler” a marca no citoplasma, determinando se o mARN é traduzido ou degradado. Assim, foi selecionada (n=120) uma série de tecidos de cancro de bexiga primário, sem qualquer tratamento, dos quais 50% são músculo-invasivo e 50% não músculo-invasivo), bem como uma série de tecidos normais. Em seguida, foi realizada quantificação proteica, por imunohistoquímica. Tal serviu para comparar a expressão em tecidos tumorais e tecidos normais, sendo que, dentro dos tecidos tumorais, a expressão diferencial nos músculo-invasivo e não músculo-invasivo também foi avaliada. A METTL3, METTL14, VIRMA, ALKBH5 e YTHDF3 apresentam uma expressão significativamente menor nos tumores por comparação com tecidos normais. Além disso, a METTL3 e a METTL14, que formam um heterodímero estável, apresentam uma redução de expressão significativa nos tumores músculo-invasivo, quando comparado com os não músculo-invasivos. Analisámos a correlação da expressão destas proteínas reguladores e da m6A entre si. Para além disso, observámos que a expressão do reader (YTHDF3) e de todos os writters estudados se correlacionou positivamente com a expressão da m6A. O mesmo foi observado em relação à expressão das erasers. Curiosamente, também foram observadas correlações entre a expressão dos writters e erasers, com exceção da WTAP com ambas as erasers, bem como do VIRMA e do FTO. Assim, estes resultados sugerem que a correlação observada entre os writters e as erasers pode ser explicada através de um feedback compensatório, ou seja, a diminuição dos escritores vai diminuir consequentemente a m6A, levando a uma diminuição das erasers que desmetilam esta modicação. A metilação desta modificação no ARN e a expressão das suas proteínas reguladoras, foi avaliada em linhas celulares de bexiga através do ensaio colorimétrico e Western blot, respetivamente. Uma linha celular normal, SVHUC-1, e sete linhas celulares tumorais foram usadas. Relativamente à modificação da m6A, não foram observadas diferenças significativas nas diferentes linhas celulares. Em relação às proteínas reguladoras, também não se observaram diferenças significativas para a expressão destas entre as linhas celulares testadas, com exceção do METTL14 que apresentou níveis bastantes variáveis, sendo a linha UMUC3, aquela com valores mais elevados desta proteína. Nesta sequência, com o objetivo de induzir in vitro a ablação da expressão do METTL14, foi realizado o knockdown deste gene na linha celular UMUC3, recorrendo ao sistema CRISPR-Cas9. Para avaliar a eficiência desta técnica, realizámos Western blot, onde foi comparada a expressão do METTL14 na linha celular com knockdown e na linha UMUC3 normal. Após confirmar a eficiência da redução da expressão em pelo menos 50% do METTL14, os níveis da modificação da m6A foram avaliados, a fim de perceber a importância desta proteína no complexo. Posteriormente, foram realizados ensaios fenotípicos para determinar o impacto da diminuição da sua expressão na linha celular de cancro de bexiga. Os ensaios in vitro demonstraram que a redução da expressão do METTL14 promoveu uma redução de 50% na modificação da m6A. Destes, os ensaios de viabilidade e proliferação celular, demonstram que a redução de METTL14 aumenta significativamente a viabilidade e proliferação das células de cancro de bexiga. Além disso, verificámos igualmente, que havia um aumento na capacidade de invasão e migração, comparativamente com as linhas controlo. Em sentido inverso, o knockdown do METTL14 traduziu-se numa redução na taxa de apoptose das células tranfectadas. Em resumo, a expressão das proteínas modeladoras da marca m6A encontram-se desregulada no cancro de bexiga. Particularmente, a regulação negativa do complexo METTL3/METTL14 metiltransferase associou-se à progressão do cancro de bexiga não musculo-invasivo para o cancro de bexiga músculo-invasivo. Estudos anteriores indicam que, embora a METTL14 não possua uma função catalítica, é capaz de formar um heterodímero com a METTL3, sendo necessário para a estabilização e função do complexo. Interações específicas entre o domínio METTL14- MTD14 e o domínio do METTL3- MTD3 são necessárias para a atividade catalítica da METTL3. Na mesma linha, descobrimos que a redução da expressão da METTL14 diminui a atividade do complexo writter e, portanto, a capacidade de estabelecer m6A nas moléculas de ARN. Estes resultados sugerem que a METTL14 poderá desempenhar um papel supressor tumoral, estando a redução da sua expressão associada a características celulares tumorais de maior agressividade.N6-methyladenosine (m6A) modification is the most abundant internal chemical modification of mRNAs in eukaryotes. Several studies revealed that m6A RNA methylation and the associated regulatory proteins, play crucial roles in the tumorigenesis processes of numerous types of cancers. However, knowledge of the mechanistic network between m6A and bladder cancer (BC) is limited and therefore it is necessary to investigate the functions of this modification. The aim of our study is to uncover the role of this modification in BC in order to understand the mechanisms associated with tumour aggressiveness. In silico analysis of TCGA data disclosed altered expression of the major m6A regulatory proteins, prompting subsequent validation. M6A, METTL3, METTL14, VIRMA, WTAP, ALKBH5, FTO and YTHDF3 protein expression were evaluated in a series of primary BC (n=120) and normal bladder (n=40) tissues. M6A RNA methylation and respective regulatory proteins expression were also assessed in bladder cell lines. METTL14 knockdown was performed in UMUC3 cell line using CRISPR-Cas9 system in order to study its relevance in bladder carcinogenesis. METTL3, METTL14, VIRMA, ALKBH5 and YTHDF3 showed significantly lower expression levels in tumour compared to normal tissues. Moreover, METTL3 and METTL14 (heterodimeric catalytic core) showed a significant reduction in muscle invasive (MIBC) comparing with non-muscle bladder cancer (NMIBC). No differences were apparent for m6A regulatory proteins’ expression among the tested cell lines, except for METTL14, that presented heterogenous levels of this writer in the different cells comparing with normal cell line. The in vitro METTL14 downregulation promoted a 50% reduction in m6A modification. METTL14 knockdown showed increased cell viability/proliferation, invasion and migration capacity, whereas decreased apoptosis was found in the same cells compared with the control. Our results suggest that METTL14 might have an important role in bladder cancer, and its expression associated with bladder cancer aggressiveness

High-tech aid tool to monitor postural stability in Parkinson’s Disease

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia BiomédicaParkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative disease that affects around 1% of the population over 65 and has increased in prevalence in recent years. One of the most disabling motor symptoms and a major contributor to falls is postural instability, which threatens the independence and well-being of people with PD. Usually, physicians assess this symptom with a traditional clinical examination named pull test, which, although easy to administer without requiring any instruments, it is a difficult test to standardize and lacks sensitivity to small but significant changes. Thus, other approaches based on high technologies have emerged to provide objective metrics and long-term data on postural stability, complementing clinical assessment. Wearable sensors appeared as a promising tech-based solution to better capture postural instability and eliminate the subjectivity of postural-associated clinical examinations. This dissertation proposes the design, development and validation of a postural assessment tool to perform more objective evaluations of postural instability during basic dynamic day-to-day activities. To achieve this goal, the following steps were accomplished: (i) create a dataset based on 3D motion data of PD patients performing the pull test and dynamic activities using an inertial measurement unit (IMU); (ii) extract relevant features from the data collected, conduct an extensive statistical search, and find correlations to clinical scales; (iii) implement a tool based in artificial intelligence (AI) to classify the level of postural instability through the data collected. Different deep learning models were designed and several combinations of data input were considered in order to find the best model to predict the pull test score. Overall, satisfactory results were achieved as the statistical analysis revealed that many features were considered relevant to distinguish between the scores of the pull test, for diagnostic purposes and also to differentiate the several stages of the disease and levels of motor disability. Regarding the AI-based tool, the results suggest that the combination of IMU-based data with deep learning may be a promising solution for postural instability assessment. The model that achieved the best performance in the testing phase with unseen data presented an accuracy, precision, recall and F1-score of approximately 0.86. The results also show that when fewer daily activities are included in the dataset, the complexity of the model reduces, making it more efficient. Despite the promising results, more data should be collected to assess the actual performance of the model as a postural assessment tool.A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa que afeta cerca de 1% da população acima de 65 anos e cuja prevalência tem aumentado nos últimos anos. Um dos sintomas motores mais incapacitantes e um dos principais contribuintes para quedas é a instabilidade postural, que ameaça a independência e o bem-estar das pessoas com a DP. Normalmente, o teste utilizado para avaliar a instabilidade postural é o pull test, que, embora fácil de executar e não necessitando de qualquer instrumento, é um teste difícil de padronizar e com falta de sensibilidade para detetar pequenas alterações que podem ser significativas. Assim, os sensores vestíveis surgiram como uma solução promissora para capturar a instabilidade postural e eliminar a subjetividade dos exames clínicos associados à postura. Esta dissertação tem como objetivo o idealizar, desenvolver e validar um instrumento para realizar avaliações mais objetivas da instabilidade postural durante atividades dinâmicas básicas do dia-a-dia. Para atingir esse objetivo, as seguintes etapas foram realizadas: (i) criar um dataset baseado em dados de movimento 3D de pacientes com a DP enquanto executam o pull test e atividades dinâmicas através de uma unidade de medida inercial; (ii) extrair características relevantes dos dados adquiridos, realizar uma extensa pesquisa estatística e encontrar correlações com escalas clínicas; (iii) implementar uma ferramenta baseada em inteligência artificial (IA) para classificar o nível de instabilidade postural através dos dados recolhidos. É de notar que diferentes frameworks de deep learning foram projetados e vários datasets foram considerados de modo a encontrar o melhor modelo para prever a pontuação da escala do pull test. No geral, os resultados alcançados foram satisfatórios, pois o estudo estatístico revelou que muitas das características extraidas dos sinais recolhidos foram consideradas relevantes para distinguir entre as pontuações do pull test, para fins diagnósticos e também para diferenciar os estágios da doença e os níveis de incapacidade motora. Em relação à ferramenta baseada em IA, os resultados apresentados sugerem que o deep learning pode ser promissor na área de avaliação de instabilidade postural através de IMUs. O modelo que obteve o melhor desempenho apresentou uma exatidão, precisão, sensibilidade e F1-score no teste de aproximadamente 0.86. Os resultados também mostram que dataset com um menor número de actividades diferentes incluídas leva a que o modelo se torne menos complexo, tornando-o mais eficiente. Apesar dos resultados promissores, mais dados devem ser recolhidos para avaliar o real desempenho do modelo como ferramenta de avaliação postural

The relevance of fiscal rules for fiscal and yield developments

Numerical fiscal rules mitigate the bias of pro-cyclicality, as an alternative to discretionary measures conducted by policy makers. We assess whether fiscal rules impact budget balances and sovereign yields, and we perform a simulation exercise to compute debt developments of EU countries, assuming that they had implemented a numerical expenditure rule in 1990. Our panel analysis covers 27 EU countries between 1990 and 2011. We find that fiscal rules contribute to the reduction of budget deficits, specifically expenditure rules, which significantly impact primary expenditure and conclude that countries with rules experienced lower sovereign bond yields. The simulations show that when the same rule is applied to different countries, it produces very different results, particularly on account of the initial level of primary expenditure

El lugar de la poesía en las orientaciones curriculares oficiales portuguesas

O artigo analisa o lugar da poesia nas diversas orientações curriculares oficiais portuguesas: no Currículo Nacional do Ensino Básico, publicado em 2001, no Programa de Português do Ensino Básico, que entrou em vigor em 2011, e nas Metas Curriculares de Português para o Ensino Básico, já em vigor. Os autores concluem que, apesar de a poesia constituir uma mais-valia para a criança, ao facultar-lhe, de modo natural e harmonioso, o domínio de uma série de competências relevantes ao nível linguístico-literário, os documentos oficiais não lhe concedem grande relevância.The article analyzes the place of poetry in several Portuguese official curriculum guidelines: in the National Curriculum of Basic Education, published in 2001, in the Portuguese Program for Basic Education, which came into force in 2011, and in the Portuguese Curricular Goals for Basic Education already in place. The authors conclude that although poetry is an asset for the child, because it provides him, in a natural and harmonious way, the domain of a range of relevant skills on the linguistic and literary levels, official documents do not provide poetry a great relevance.El artículo analiza el lugar de la poesía en varios textos curriculares oficiales portugueses: en el Currículo Nacional de Educación Básica, publicado en 2001, en el Programa Portugués para la Educación Básica, que entró en vigor en 2011, y los Objetivos de Portugués Curriculares para la Educación Básica ya en el lugar. Los autores concluyen que aunque la poesía constituye un activo para el niño, por ofrecerle, de una manera natural y armoniosa, el dominio de una serie de habilidades relacionadas con el nivel lingüístico y literario, los documentos oficiales no le proporcionan gran relevancia.CIEC - Centro de Investigação em Estudos da Criança, IE, UMinho (UI 317 da FCT), Portugalinfo:eu-repo/semantics/publishedVersio

The relevance of fiscal rules for fiscal and sovereign yield developments

We assess whether numerical fiscal rules impact budget balances and sovereign yields. For a panel of 27 EU countries between 1990 and 2011, we find that fiscal rules reduce budget deficits, specifically expenditure rules, while countries with better fiscal rules experienced lower sovereign bond yields.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

The interaction between malaria infection and parental age on nest defence behaviour

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina VeterináriaReproduction is a costly phase of the life cycle and in order to maximize reproductive success organisms are faced with trade-offs between different life history traits. While the presence of these trade-offs is obvious, there might be key differences in how they are solved within a population. Suppression or clearance of parasite infection requires investment in immunological responses, which leads to a reduction in investment in other costly functions. Parasite infection and parasite load may therefore cause changes in host’s behaviour, including parental care behaviours, such as nest defence. However, whether infection affects these behaviours differently, depending on the age of the parent remains largely unexplored, especially in wild systems. Behavioural data and blood samples were collected from 206 collared flycatchers (Ficedula albicollis). We found a significant effect of the interaction between parental age and malaria infection on nest defence behaviours. One year old, infected birds had a lower frequency of nest defence behaviours than uninfected one year old ones, whereas the opposite pattern was present in older specimens. As previous studies suggest that young individuals may suffer more from acute infection, we argue that our findings imply that young infected individuals are in such a poor shape that they need to lower their activity level (i.e. we observe a direct cost of infection in term of lowered activity). In older individuals, a shift towards increased investment in current reproduction (i.e.terminal investment) is a likely explanation to increased risk-taking.RESUMO - A fase reprodutiva tem um elevado custo energético no ciclo de vida e, de forma a garantir o sucesso reprodutivo, os indivíduos são confrontados com conflitos de escolha. Apesar da existência destes conflitos ser evidente, podem existir diferenças na forma como são resolvidos dentro de uma população. A supressão ou eliminação de uma infeção parasitária requer investimento em resposta imunitária, o que leva a menor investimento disponível para outras actividades de elevado custo energético. A infeção e a carga parasitária podem, portanto, causar alterações no compor-tamento do hospedeiro, inclusive nos cuidados parentais, tais como a defesa do ninho. No entanto, permanece por explorar se a infecção parasitária afecta de forma diferenciada estes comportamentos dependendo da idade do progenitor, em particular em populações selvagens. Foram colhidos dados de observação de comportamento e colhidas amostras de sangue de 206 papa-moscas-de-colar (Ficedula albicollis). Os resultados revelam um efeito significativo da interação entre a idade dos progenitores e a infecção por malária nos comportamentos de defesa de ninho. Indivíduos juvenis infectados apresentam uma frequência de defesa de ninho inferior a indivíduos não infectados, enquanto o contrário se verifica em indivíduos mais velhos. Tal como estudos anteriores sugerem que indivíduos jovens podem ser mais afectados por infecção aguda, sugere-se aqui que estes resultados implicam que indivíduos jovens infectados se encontram em condição geral diminuída de tal forma, que necessitam diminuir o seu nível de atividade (i.e. observa-se um custo direto da infeção em termos de diminuição de atividade). Em indivíduos mais velhos, um aumento no investimento na reprodução (i.e. investimento terminal) pode explicar o aumento nos comportamentos de risco.N/

Fiscal rules : budgetary and sovereign yield developments

Mestrado em Economia Monetária e FinanceiraNumerical fiscal rules appear in the literature as a solution for the bias of pro-cyclicality and as an alternative to discretionary measures conducted by policy makers. With this work we will try to understand if fiscal rules do, in fact, impact budget balances and sovereign yields, and afterwards perform a simulation exercise to assess what would have been the debt level if a numerical expenditure rule had been applied in 1990. The empirical analysis is based in a data panel of 27 EU countries covering the years between 1990 and 2011. We find that fiscal rules contribute to the reduction of budget balances, specifically expenditure rules significantly impact primary expenditure and that countries with rules applied experienced smaller sovereign bond yields. The simulations show that the same rule applied to different countries produces very different results, particularly due to the initial level of primary expenditure

Robust phoneme recognition for a speech therapy environment

Traditional speech therapy approaches for speech sound disorders have a lot of advantages to gain from computerbased therapy systems. With speech recognition techniques the motivation elements of these systems can be automated in order to get an interactive environment that motivates the therapy attendee towards better performances. Here we propose a robust phoneme recognition solution for an interactive environment for speech therapy. We compare the results of hierarchical and flat classification, with naive Bayes, support vector machines andkernel density estimation on linear predictive coding coefficients and Mel-frequency cepstral coefficients.N/